免疫組化原理
免疫組化染色是用一抗與被檢測(cè)組織中目的蛋白抗原結(jié)合，然后用HRP等標(biāo)記的二抗與一抗進(jìn)行結(jié)合，后通過與DAB顯色劑反應(yīng)，進(jìn)而確認(rèn)所要檢測(cè)蛋白抗原的定位、半定量等目的。
? 免疫組化更多的意義在于查看目的蛋白的定位。定量一般用western來實(shí)現(xiàn)。
免疫組化染色和HE染色的不同之處可能是HE染色比較粗略地辨認(rèn)不同細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變；而后者能夠針對(duì)特異性細(xì)胞標(biāo)志物來檢測(cè)特異性細(xì)胞的改變（數(shù)量）、也可檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)位，組織中一些特異性蛋白的表達(dá)的量改變（通過圖像分析系統(tǒng)分析顏色深淺、分布的面積等綜合分析）。
? 通俗的講，HE僅僅是看大體病理改變，比如組織壞死，比如炎性滲出。免疫組化，看你的目的蛋白的表達(dá)情況。
免疫組化和HE染色的對(duì)比
DAB和HE一樣也是一種染色劑，HE染色相對(duì)簡(jiǎn)單，能分辨出細(xì)胞中的嗜酸嗜堿性物質(zhì)；DAB染色全稱應(yīng)該叫做免疫組化DAB染色，經(jīng)過一系列復(fù)雜的生化反應(yīng)后，DAB(二氨基聯(lián)苯胺)染色劑能將辣根過氧化物酶染成棕色。
常用的免疫組化染色方法
組化用HRP的話，信號(hào)不夠強(qiáng)。通常用生物素標(biāo)記HRP來增強(qiáng)信號(hào)。
ABC法（卵白素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物法）
? ABC法是利用卵白素與生物素*的高度親和力特性，與生物素化二抗結(jié)合，形成抗原＋特異性抗體＋生物素化二抗＋卵白素＋生物素＋HRP復(fù)合物，后DAB顯色。
? 復(fù)合物配制：先將生物素與酶結(jié)合，形成生物素化HRP，以生物素化HRP與卵白素按一定比例混合，形成卵白素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物。
SP法（抗生物素蛋白鏈酶素-過氧化物酶復(fù)合物）
? 本身沒有連接生物素，但有兩個(gè)生物素親和力*的結(jié)合位點(diǎn)，可以與二抗上的生物素結(jié)合，敏感性高，復(fù)合物不需要使用前混合，更為簡(jiǎn)便。
PAP法
直接法
樣本制備
免疫組化結(jié)果分析
免疫組化結(jié)果的判斷原則：
? 必須設(shè)陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。
? 抗原表達(dá)必須在特定部位。
? 陰性結(jié)果不能視為抗原不表達(dá)。
免疫組化染色實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組結(jié)果分析表
從表可以看出只有6、7實(shí)驗(yàn)結(jié)果有意義。1-5均因?qū)φ战M的結(jié)果已否定Ab的特異性或IHC技術(shù)操作存在錯(cuò)誤等而使實(shí)驗(yàn)結(jié)果失去意義，必須重復(fù)實(shí)驗(yàn)或換用Ab。
染色失敗的幾種情況及原因
染色失敗的幾種情況。
? 所染的全部切片均為陰性結(jié)果，包括陽性對(duì)照在內(nèi)。
? 所有切片均呈陽性反應(yīng)。
? 所有切片背景過深。
? 陽性對(duì)照染色良好，檢測(cè)的陽性標(biāo)本呈陰性反應(yīng)。
所有切片呈陽性反應(yīng)，其原因:
? 切片在染色過程中抗體過濃，或干片了。
? 緩沖液配置中未加氯化納和PH值不準(zhǔn)確， 洗滌不*。
? 使用已變色的呈色底物溶液，或呈色反 應(yīng)時(shí)間過長。
? 抗體溫育的時(shí)間過長。
? H2O2濃度過高，呈色速度過快且粘附劑太厚。
所有切片背景過深，其原因:
? 內(nèi)源性過氧化酶沒有*阻斷。
? 切片或涂片過厚。
? 漂洗不夠。
? 底物呈色反應(yīng)過久。
? 蛋白質(zhì)封閉不夠或所用血清溶血。
? 使用全血清抗體稀釋不夠。
陽性對(duì)照染色良好，檢測(cè)的陽性標(biāo)本呈陰性反應(yīng)。
? 常見的原因:
標(biāo)本固定和處理不當(dāng)。
注意事項(xiàng)
? 蘇木素復(fù)染時(shí)間需要摸索，尤其要考慮陽性染色的位置。
? 切片脫蠟和水化要充分；加反應(yīng)液時(shí)要覆蓋組織充分；每次加液前甩干洗滌液，但又防止干片。
?以下原因可能導(dǎo)致片子著色不均勻：
①脫蠟不充分。可以60℃烤20min，立即放入新鮮的二甲苯中。
②水化不全。應(yīng)經(jīng)常配制新鮮的梯度乙醇。
③抗體沒混勻。用移液器充分混勻一抗/二抗等試劑。④抗體孵育時(shí)，切片放傾斜。
⑤抗體孵育后PBS沖洗不充分。
⑥制片厚薄不均勻等問題。
⑦染片盒不平，切片傾斜。
?一抗的清洗:
單獨(dú)沖洗，防止交叉反應(yīng)造成污染。
溫柔沖洗，防止切片的脫落，推薦用浸洗方式。
沖洗的時(shí)間要足夠，才能*洗去 結(jié)合的物質(zhì)。
?PBS的PH和離子強(qiáng)度的使用。
建議PH在7.4-7.6濃度是0.01 M。
中性及弱鹼性條件（PH7-8）有利 于免疫復(fù)合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強(qiáng)度有利于免疫復(fù)合物的形成，而高離子強(qiáng)度則有利 于分解。
?拍照
有條件的話應(yīng)該立即拍照，若不能及時(shí)拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和濕度。
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